CRISPR i matične stanice - Promjena staničnog identiteta i spremanje života

Prema podacima Ujedinjene mreže za dijeljenje organa, svakih deset minuta na popis darivatelja dodaje se netko. Istovremeno, u prosjeku 20 umre čekajući organ svaki dan. Samo u 2016. godini na listi čekanja umrlo je više od 7000 pacijenata ...

Ako postoji nešto gore od smrti, čeka se da vidite hoćete li umrijeti ili ne. I nikad se ne zna.

Nešto se mora dogoditi. Srećom, uspjelo je. Prije deset godina Takahashi i Yamanaka sa sveučilišta Kyoto u Japanu uspješno su transformirali somatske stanice u inducirane pluripotentne matične stanice - vrstu ćelije koja je slična onoj koja je izvađena iz našeg embrija. Drugim riječima, oni mogu uzeti bilo koju stanicu iz vašeg tijela koja nije reproduktivna i pretvoriti je u stanicu koja ima oblik embriona, koja se može podijeliti na neodređeno vrijeme, razmnožavati i razlikovati u ciljnu staničnu vrstu, poput krvnih stanica ili neurona.

Ti su kardiomiociti reprogramirani iz normalnih uzoraka kože odraslih ljudi. Zasluge: Matt Spindler / Gladstone Instituti

Idemo kopati i shvatiti kako to stvarno djeluje!

Stanično reprogramiranje: „Eksperiment u Yamanaki“

Ideja je bila jednostavna: mali niz faktora transkripcije (TFs), kada se izrazi u somatskoj ćeliji, može ga reprogramirati natrag u pluripotentno stanje. O TF-ima možete razmišljati kao o instruktoru koji ćelijama govori što treba raditi. Ako ćelije dobiju ispravne upute, kretat će se u pravom smjeru. Nakon nekih analiza, Yamanakin tim uzeo je 24 gena kandidata, odabranih uglavnom zbog njihove visoke ekspresije i specifičnosti u pluripotentnim stanicama. Potom su integrirali retroviruse, noseći gene, u somatske stanice odraslih (na primjer, stanice kože) kako bi ih eksprimirali. Nakon razdoblja inkubacije, oni uvode markerski gen koji se aktivira samo u pluripotentnim stanicama.

Nastavili su s postupkom sužavanja gena koktela na četiri faktora reprogramiranja: Klf4, Sox2, Oct4 i Myc, KS.a. KSOM.

Ukratko, dokazali su da će uvođenjem ova četiri faktora u bilo koje somatske stanice stanice postati pluripotentne, imajući mogućnost diferencijacije u različite vrste stanica i tvore tkiva.

U stvarnom životu odrasli ljudi vjerojatno dominiraju svijetom. Ali u staničnim svjetovima, čak su i "odrasli" prisiljeni postati "bebe" kako bi supersila bila besmrtna, nastavila dijeliti i "preuređivati" svoj život postajući tip ćelije kakvom im težimo.

Ti neuroni dobiveni iPSC-om nastali su iz tkiva uzetog od ljudskih pacijenata s Huntingtonovom bolešću. Nada u budućnost je da će nenormalne stanice pacijenata s naslijeđenim bolestima kao što je Huntington biti moguće reprogramirati u stanje pluripotentnih matičnih stanica, „urediti“ pomoću CRISPR-a i zatim presaditi u pacijente kako bi obnovile normalnu funkciju. Zasluge: Julia Kaye / Gladstone Institutes

Daleko od terapije zamjene ćelija koje se temelje na iPSC-u

U osnovnoj znanosti sposobnost dobivanja iPSC-a iz pacijentskih stanica imala je ogroman utjecaj na modeliranje bolesti kod ljudi. Desetljećima smo modelirali genetske bolesti i provodili ispitivanja lijekova ili eksperimente genske terapije na životinjama, poput miševa ili zebra.

Sada nam iPSC tehnologija omogućava istraživanje obiteljskih genetskih bolesti u kontekstu neurona i tkiva koji potječu od pacijenta.

Na slici je mikroskopski prikaz moždanih stanica nastalih iz induciranih pluripotentnih matičnih stanica u laboratoriju neuroznanstvenika Sveučilišta Wisconsin-Madison Su-Chun Zhang. Čini se da inducirane stanice, dobivene iz reprogramiranih stanica kože, imaju mnoge svestrane kvalitete ljudskih embrionalnih matičnih stanica.

Pojava iPSC-a također je prekinula monopol monopola stanične stanice. Prije toga, stanice raka bile su jedini pouzdan izvor ljudskih besmrtnih stanica. Kao i karcinomi, iPSC-ovi su besmrtni, ali ne trpe nedostatke patološki izmijenjenih genoma stanica karcinoma, a ipak zadržavaju svoju sposobnost razlikovanja u bilo kojoj staničnoj vrsti interesa. U kraljevstvu Akademije, Allen Institut za stanične znanosti pokrenuo je knjižnicu karakterističnih iPSC-ova industrijske razmjere koja će se koristiti za stvaranje vizualnog, animiranog modela stanice, sugerirajući da će iPSC-i uskoro zamijeniti stanice karcinoma kao model sustava za osnovne stanična biologija.

iPSC je sjajan, ali još nije savršen ...

Jedan izazov je što pojedinačne iPSC linije nisu identične i nismo sigurni na koji način te varijable utječu na potencijal linije da se razlikuje u funkcijske ćelije.

Neke razlike su jednostavno polimorfizmi s jednim nukleotidom (SNP). Svaki SNP predstavlja razliku u jedinstvenom bloku DNA, koji se naziva nukleotid. Na primjer, SNP može zamijeniti nukleotidni citozin (C) nukleotidnim timinom (T) u određenom dijelu DNK. U ljudskom genomu postoje milijuni SNP-a i oni variraju među ljudima. Iako se zna da većina SNP-a nekodira ili regulira, oni stvaraju buku podataka kada pokušavamo identificirati značajne genetske razlike kako bismo došli do sigurne, učinkovite kliničke primjene.

Ilustracija polimorfizama s jednim nukleotidom (SNP) iz DNA enciklopedije

Stanje interpretacije podataka pogoršava se sporadičnim, poligenim bolestima. Dok su neke bolesti, poput krhkog sindroma X, uzrokovane mutacijom na jednom alelu (aka monoallelic), druge su uzrokovane višestrukim genetskim faktorima rizika, kao što je istaknuto u Studijama o udruživanju genoma (GWAS) - istraživanjima udruga koja se odnose na genom. između različitih pojedinaca kako bi vidjeli postoji li zajednička varijanta koja vodi ka zajedničkoj osobini. To su poznate kao poligene bolesti (poligon mnogo znači). Pokazano je da okoliš utječe i na ove višestruke faktore rizika.

Transkripcija FMR1 se utišava zbog hipermetilacije DNA, a odsutnost FMRP-a rezultira krhkim X sindromom. (Preuzeto iz „Miševi modeli krhkog X premutacije i krhkog sindroma tremor / ataksije povezan s X“ u časopisu Neurodevelopmental Disorders (6) 1:25)
Naš je prioritet sortirati ove podatke kako bismo razlikovali zbunjujuće tehničke / metodološke varijacije od smislenih bioloških.

U našem nastojanju da razumijemo potencijale iPSC linija za razlikovanje, važno je shvatiti od čega počinje stanična diferencijacija.

Zamislite interakcije u našoj ćeliji kao lutkarsku predstavu. Zaostaju ljudi koji kontroliraju kako se proces odvija, rađajući različite „likove“ (a.k.a naše stanice) s jedinstvenim identitetom.

Metilacija DNA proces je u kojem se metilnoj (CH3-) skupini dodaju molekuli DNA. Kad se nalazi u genskom promotoru, metilacija DNA obično djeluje na potiskivanje transkripcije gena. (Slika sa Wikipedije)Mogući putovi metilacije i demetilacije (Slika sa Wikipedije)

Nakon nekih istraživanja, znanstvenici su otkrili da su glavni kontroler regulatori metilacije DNA i modifikacije histona. Dakle, broj različito metiliranih regija (DMR) bio bi važan čimbenik u razumijevanju sposobnosti diferencijacije stanice. U osnovi, jednostavno morate shvatiti koliko DMR-a ima taj marionetski kontrolor na popisu i koliko ima unutar svake ćelije.

Zanimljivo je i da li se iza tog lutkovnog kontrolera krije neki tajni agent koji bi ga obavijestio što treba učiniti. Odgovor je snažno da - to je faktor seksa! Tijekom staničnog reprogramiranja, somatske stanice koje potječu od žena moraju prevladati dodatnu barijeru u odnosu na stanice dobivene od muškaraca, a to je reaktivacija neaktivnog X kromosoma. Nadalje, poznato je da u ženskim iPSC ima više DMR-a lokaliziranih na kromosomima X nego u muškaraca. Doista, seks je glavni čimbenik koji objašnjava različite obrasce metilacije među iPSC linijama! Drugi je čimbenik dob, tako da je važno stratificirati različite iPSC ćelijske linije po različitim dobnim skupinama.

Prihvatimo ono što smo do sada znali o potencijalu za diferencijaciju t iPSC-a:

DMRs → razlikovati vrste stanica. Ali, problem „SNP-a i poligenih bolesti“ nije riješen → Trebate sortirati podatke da biste znali učinke svakog faktora rizika na izražavanje određene osobine.

Ok, cool. Idemo dalje. Skoro smo tamo!

CRISPR-Cas: Ulazak u igru ​​iPSC

(Prije nego što nastavite čitati, ovaj videozapis možete pogledati ovdje ili pročitati moj prethodni članak ovdje da biste shvatili kako funkcionira CRISPR.)

Da bismo proučili učinke različitih čimbenika rizika na izražavanje bolesti, moramo učiniti dvije stvari:

  1. Uspostavite kontrolnu i ispitnu grupu
  2. Isključite jedan po jedan gen faktora rizika da biste vidjeli postoji li gubitak funkcije

U pametnijim riječima (poznavanje istih vam može pomoći da shvatite buduće radove), dva su koraka uključena u uspostavljanje izogene stanice. Izogene stanične linije nastaju postupkom koji se naziva homologno ciljanje gena. U osnovi, to znači da možemo upotrijebiti alat poput CRISPR-a za ukidanje ili uklanjanje željenih mutacija ili SNP-ova koji uzrokuju bolest.

Ljudske stanice epitela divljeg tipa podvrgavaju se genskom ciljanju da bi se stvorili izogeni derivati ​​koji sadrže jednu PIK3CA onkogenu mutaciju (knock-in) ili istu PIK3CA mutaciju zajedno s KRAS onkogenom mutacijom (double knock-in). Stanice se zatim paralelno podvrgavaju lijekovima za procjenu osjetljivosti na rezistenciju (J Clin Invest. 2010; 120 (8): 2655-2658. Doi: 10.1172 / JCI44026.)

Nedavna istraživanja pokazala su uspjeh u takvoj metodi, kao u slučaju dešifriranja utjecaja varijanti rizika povezanih s Parkinsonovom krizom. Nakon uvođenja uobičajene varijante rizika povezanog s PD-om u nekodirajućem pojačivačkom području, SNCA gen se deregulirao za 10%. Kako je SNCA odgovorna za proizvodnju alfa-sinukleina - proteina u presinaptičkim predajnicima u mozgu, gdje se oslobađaju neurotransmiteri. Manjak SNCA može ozbiljno narušiti normalnu aktivnost mozga. Ovo je samo jedan primjer korištenja CRISPR-a za uspostavljanje izogenih staničnih linija za uklanjanje SNP-a („šumovi podataka“) i proučavanje pojedinačnih (ili kombinacija) ili različitih faktora rizika kod poligenih bolesti.

Međutim, utjecaj CRISPR-a na iPSC modele je izvan brzog i učinkovitog uređivanja gena. Kao što znamo, katalitički aktivni Cas protein ima dvije domene - RuVC-ove i HNH - obje djeluju kao škare kako bi izazvale dvolančane lomove (DSB) na našim željenim genomskim lokusima.

Ako se ove dvije domene promijene, izgubit će značajku rezanja i deaktivirani Cas protein (dCas).

Možete se zapitati: Zašto bismo na zemlji isključili funkciju uređivanja alata za uređivanje gena poput CRISPR? Odgovor je: spojiti dCas9 s drugim funkcionalnim proteinima radi aktiviranja ili suzbijanja aktivnosti gena na ciljnom mjestu.

  • Kad se dCas9 spoji s Kruppelovom pripadajućom kutijom (KRAB), transkripcijskom represivnom domenom, potiskuje se transkripcija i sustav naziva CRISPR interferencija (CRISPRi).
  • Kad se dCas9 spoji sa SunTag, nizom koji sadrži više kopija domene za regrutovanje aktivatora općeg kontrolnog proteina (GCN4), sustav aktivira transkripciju i naziva se CRISPR aktivacija (CRISPRa).

Aktivacija i potiskivanje određenih gena može nam pomoći u proučavanju funkcije tih gena. Nadalje, fuzija između dCas i fluorescentnog izvještača omogućava nam vizualizaciju nuklearne organizacije i specifičnih genskih mjesta.

... Pa što trebamo znati?

  • Trebamo zamjenu za organe u doniranju, a inducirane pluripotentne matične stanice (iPSC) su obećavajuće rješenje. Ima potencijal za zamjenske terapije i služi kao model za promjenu igre za proučavanje bolesti.
  • CRISPR pomaže u uspostavljanju izogenih staničnih linija kako bi se proučio utjecaj više faktora rizika kod poligenih bolesti, uglavnom generiranjem izbacivanja. Također eliminira buku podataka isključivanjem pojedinačnih nukleotidnih polimorfizama (SNP). Pruža ispitivanim ćelijama svojevrsnu uniformnost, tako da možemo pronaći najučinkovitiji, najpouzdaniji iPSC za kliničku primjenu.
  • dCas9 aktiviraju i potiskuju gene što nam omogućava proučavanje njihovih funkcija. To se može upotrijebiti u screeningima za čitav genom, od kojih je jedna popularna vrsta probir gubitaka.

Bez sumnje, brak između iPSC-a i CRISPR-a mijenja se igrama na čelu regenerativne medicine, čime se približava praktičnim kliničkim primjenama!

Moja osobna bilješka i daljnje čitanje

Napredak postignut u matičnim stanicama i CRISPR meni djeluje upravo nevjerojatno. Kolektivni napori znanstvenika tijekom njihovih sedam godina proučavanja iPSC-a - nešto za što tada nisu ni znali da će funkcionirati - pa im se potencijalna primjena ozbiljno divi. Čitajući ove radove, oni me uče ne samo znanju, već i stavu prema znanstvenom istraživanju - strpljenju, optimizmu i upornosti.

Ako ste uzbuđeni kao i ja i volite zamisliti budućnost regenerativne medicine, preporučujem vam sljedeća čitanja:

  • Inženjeriranje linija matičnih ćelija s inducibilnim genskim izbijanjem pomoću CRISPR / Cas9
  • Poglavlje 2 - Molekularna klinička genetika i genska terapija (dječja kirurgija - izdanje 7.0)
  • Srebrna obloga inducirane pluripotentne varijacije matičnih stanica
  • Pregled inducirane pluripotentne matične stanice, izravna pretvorba trans-diferencijacijom, izravno reprogramiranje i diferencijacija oligodendrocita
  • CRISPR / Cas9 inženjering epigenoma
  • CRISPR / Cas-9 u uređivanju genoma i šire
  • Dostava nanočestica Cas9 ribonukleoproteina i donorske DNK in vivo inducira homologno usmjerenu popravku DNK
  • Uređivanje CRISPR / Cas9 genoma u ljudskim stanicama hematopoeze

Uživajte i budite pozorni na moje buduće članke!